2.3 LOPs及其双重乳液体外模拟吸收与转运特性分析

2.3.1 LOPs及其双重乳液对Caco-2细胞毒性分析

LOPs及其双重乳液对Caco-2细胞的毒性，实验结果见图8。由图8(a)可知，质量分数为0.25%、0.50%和3.00%的LOPs未能促进Caco-2细胞生长;当LOPs的质量分数超过6.00%时，细胞存活率极低，推测此质量分数的LOPs对细胞的渗透压过高或过量的物质导致细胞死亡;当LOPs的质量分数为1.00%～2.50%时，细胞存活率(相对于无LOPs培养液对照组)均无显著性差异，出现这类情况可能是由于，LOPs是含有各种氨基酸的多肽，添加了特定浓度的LOPs可能在一定程度上比常规细胞培养液促进了Caco-2的生长。根据预实验结果，质量分数为2.00%的LOPs，在BL侧可测得透过的LOPs含量在检测的合适范围，因此选择质量分数为2.00%的LOPs进行后续实验。由图8(b)可知，LOPs的双重乳液对Caco-2细胞的存活率的影响随着乳液稀释倍数的提高而不断上升，这可能与双重乳液中的乳化剂和大豆油对细胞具有一定的毒性有关。稀释倍数过低的双重乳液还可能对细胞产生高渗透作用，若LOPs双重乳液的稀释倍数过高，所含LOPs浓度过低，无法达到后续转运实验的条件。因此，综合实验结果，选用具有较高Caco-2细胞存活率的质量分数为2.00%的LOPs、100倍稀释处理的LOPs双重乳液进行后续的转运实验。

不同小写字母表示各组数据间存在显著差异(P<0.05)。

图8 LOPs及LOPs双重乳液对Caco-2细胞的毒性

2.3.2单层Caco-2细胞模型的验证

2.3.2.1 TEER的测定

单层Caco-2细胞模型的完整性和致密性可以通过TEER进行评估。一般情况下，认为当单层细胞的TEER高于300Ω·cm2时，单层Caco-2细胞就可以用于进一步的实验。图9为不同初始密度的单层Caco-2细胞两侧的跨膜电阻随培养时间的变化情况。由图9可知，整个实验周期，单层Caco-2细胞的初始接种密度对最终电阻的影响不大。前期细胞跨膜电阻变化缓慢，培养9 d后，跨膜电阻出现大幅度增长，在培养17 d后的电阻趋于稳定，最后的电阻稳定于375Ω·cm2附近，表明单层Caco-2细胞模型具有中度紧密度。

图9 Caco-2细胞培养过程中的TEER

2.3.2.2碱性磷酸酶活性的测定

Caco-2细胞培养状态及培养21 d后的碱性磷酸酶活性见图10。由图10(a)、(b)可以发现，培养3 d过程中，单层Caco-2细胞生长稳定并均匀分布在Transwell上，贴壁情况良好。碱性磷酸酶AKP是小肠刷状缘细胞的标志酶，其浓度代表了单层Caco-2细胞的极化和功能。观察图10(c)可知，培养21 d后，不同接种细胞密度在AP侧的酶活性均高于BL侧的酶活性，属正常的细胞极化结果。初始密度为3×105个/mL的细胞AP侧的AKP活性高于其他两组，其BL侧的AKP活性低于其他两组，证明该组细胞分化情况较好。随着细胞密度的增大，AP侧与BP侧活力的比值呈下降趋势，说明初始细胞密度过大不利于细胞的分化。实验结果表明，3种模型细胞均生长良好。

光学显微镜放大倍数为10×40;不同小写字母表示AP侧的组间数据存在显著差异(P<0.05)，不同大写字母表示BL侧的组间数据存在显著差异(P<0.05)。

图10 Caco-2细胞的生长状态及培养21 d后碱性磷酸酶的活性

2.3.2.3荧光素钠透过率测定

标记物跨膜通量的测定也可以反映单层细胞膜的完整性，荧光素钠标准吸收曲线及其在不同时间段的透过率见图11。由图11(a)的荧光素钠的标准曲线方程中，代入BL侧的吸光度，可计算出BL侧的荧光素钠质量，根据式(4)，即可得出不同时间段的荧光素钠透过率[图11(b)]。由图11(b)可知，孵育2 h后，3个不同初始密度的细胞模型均对荧光素钠具有一定的透过性。初始细胞密度为3×105个/mL的细胞模型对荧光素钠的透过率相对较高，达到13.96%;初始AP侧加入荧光素钠的密度为20μg/mL，最终3种模型的荧光素钠透过量均小于0.011 6μg/min，说明3种细胞模型单层膜的致密性能良好。

图11荧光素钠标准吸收曲线及其透过率

本实验比较了3种初始细胞密度培养的细胞模型，3种模型的Caco-2细胞与细胞之间连接紧密，均具有良好的致密性和完整性，且已极性分化，表明已成功构建了单层Caco-2细胞模型，3种密度的细胞模型均可用于跨膜转运吸收实验。

2.3.3 LOPs及其双乳液的转运方式分析

药物或营养物质通过单层Caco-2细胞模型的表观渗透系数(Papp)与其体内吸收具有良好的相关性。现行国际物质运输判断标准:Papp值高于1×10-5 cm/s，吸收率在70%～100%，表明吸收良好;Papp值为1.0×10-6～1.0×10-5 cm/s，表现出吸收率为20%～70%，表明吸收适中;Papp值<1.0×10-6 cm/s，表现吸收率为0～20%，表明吸收不良。此外，Papp(BL-AP)与Papp(AP-BL)的比值(流出比)是药物递送行为的重要指标，如果比值小于0.5，则表明主要运输方式是外流效应，比值在0.5～1.8，则说明主要转运机制为被动扩散，比值大于1.8，说明主要运输方式是主动运输。根据本研究结果，黄瓜视频免费下载将3种初始密度不同的单层Caco-2细胞模型均用于模拟吸收实验，分析结果见图12。由图12(a)和图12(b)可知，3种模型的Rapp值均高于1×10-5 cm/s，实验结果表明，单层Caco-2细胞对LOPs及其双重乳液的吸收良好。由图12(c)可知，LOPs的流出比约为0.7，LOPs双重乳液的流出比约为0.3，说明LOPs的转运方式为被动扩散，LOPs双重乳液的转运机制为外流效应。然而，相比于LOPs的流出比，LOPs双重乳液的流出比较小，说明双重乳液对LOPs存在缓释作用。

图(a)和图(b)中，不同大写、小写字母分别表示LOPs、LOPs双重乳液的组间表观渗透系数存在显著差异(P<0.05)，图(c)中，不同大写、小写字母分别表示LOPs、LOPs双重乳液的组间流出比存在显著差异(P<0.05)。

图12 LOPs及其双重乳液的渗透系数及流出比

3结论

本研究基于LOPs的界面性质，分析包封LOPs的W1/O/W2双重乳液的体外模拟消化与吸收特性。研究结果表明，LOPs具有强亲水性，但不具有降低油水间界面张力的能力，不具备乳化特性，需添加相应乳化剂以稳定构建包封LOPs的W1/O/W2双重乳液。体外模拟消化吸收实验结果表明:LOPs双重乳液经模拟口腔、胃消化及小肠消化，整个消化过程乳液粒径呈现先增大后下降的趋势，LOPs的包封率随之下降;LOPs双重乳液在胃部酸环境下发生聚集，而后到达肠道消化阶段因双重结构被小肠消化酶降解破裂释放出大部分的LOPs，表明双重乳液结构对LOPs具有一定的保护及缓释作用。采用单层Caco-2细胞模型模拟体外吸收实验，结果显示:单层Caco-2细胞对LOPs及其双重乳液的吸收特性良好，其中，LOPs以被动扩散的方式进行转运，而LOPs双重乳液的转运方式为外流效应;LOPs双重乳液的流出比小于LOPs的流出比，说明双重乳液的包封作用对LOPs具有一定的延长吸收及长效作用。研究结果旨在为阐明包封水溶性生物活性肽的W1/O/W2型双重乳液的消化、吸收及转运机制提供一定参考。